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            活體成像研究底物之:Firefly D-Luciferin D-蟲熒光素(Luc基因)
            時間:2018-10-19     作者:懋康原創     文章來源:懋康生物    

            活體成像研究底物之:

            Firefly D-Luciferin D-蟲熒光素(Luc基因)

            (活體成像研究/體外生物發光研究/轉錄水平研究)

             

             

            【重要提示】:

            1)見我司懋康生物(MKBio)整理的活體成像研究底物之:腔腸素(Coelenterazine)產品專題;

            2)見我司懋康生物(MKBio)整理的活體成像研究底物之:D-熒光素(D-luciferin)產品專題;

            3)見我司懋康生物(MKBio)整理的D-熒光素(D-luciferin)常見問題;

            4)見我司懋康生物(MKBio)整理的D-熒光素(D-luciferin)體外使用指南;敬請期待。。。。

            5)見我司懋康生物(MKBio)整理的D-熒光素(D-luciferin)體內使用指南;敬請期待。。。。

             

            搜索關鍵詞:

            Luc reporter gene 報告基因;Luciferase 螢火蟲熒光素酶;In vivo imaging 活體成像研究;熒光素酶/ATP水平研究;報告基因質粒;報告基因病毒顆粒;螢火蟲熒光素;甲蟲熒光素;CAS:103404-75-7;

             

            基本描述:

            D-熒光素(D-Luciferin)是熒光素酶(Luciferase)的常用底物,普遍用于整個生物技術領域,特別是體內活體成像技術。作用機制是在ATP和熒光素酶的作用下,D-熒光素(底物)被氧化發光。當熒光素過量時,產生的光量子數與熒光素酶的濃度呈正相關性(見下圖)。將攜帶熒光素酶編碼基因(Luc)的質粒轉染進入細胞后,導入研究動物如大小鼠體內,之后注入熒光素,通過生物發光成像技術(BLI)來檢測光強度變化,從而實時監測疾病發展狀態或藥物的治療功效等。也可以利用ATP對此反應體系的影響,根據生物發光強度的變化來指示能量或生命體征。

             

            基本應用:

            1)體內活體成像In vivo imaging;熒光素酶標記的腫瘤細胞、干細胞或傳染疾病通常注射入研究動物模型比如大小鼠內進行研究,從而對動物模型進行實時和非侵略性的監測疾病進程和/或藥效。

            2)體外研究,包括熒光素酶和ATP水平分析;報告基因分析;高通量測序和各種污染檢測。

             

            常見商業化類型的差異(熒光素鉀,鈉,游離酸):

            目前市場上常見的有三種產品形式,D-熒光素(游離酸),D-熒光素(鈉鹽),和D-熒光素(鉀鹽)。這三種產品主要差別在于溶解特性。

            1)D-熒光素(游離酸)在水以及緩沖體系內的溶解性都很弱,除非溶于弱堿如NaOH和KOH溶液。溶于甲醇(10 mg/ml)和DMSO(50 mg/ml)。

            2)D-熒光素(鈉鹽)和D-熒光素(鉀鹽)能夠非常容易且快速的溶入水或者緩沖液中,使用方便,溶劑無毒性,特別適合體內實驗。配成溶液后的三種產品,在絕大多數應用上都沒有實質性的差別。

            3)D-熒光素(鈉鹽)和D-熒光素(鉀鹽)基本上沒有差別,主要是使用習慣等因素影響。整體來看,鉀鹽的應用文獻明顯多于鈉鹽。

             

            使用方法【體內成像/腹腔注射】

            一.  儲存液制備(Luciferin preparation)

            1.1    將D-熒光素鉀鹽(或D-熒光素鈉鹽)凍干粉回至室溫,溶于DPBS(無鈣/鎂)使其終濃度為15mg/ml。

            1.2    用0.22μm濾膜過濾除菌,條件許可現配現用。若單次實在用不完,則分裝后置于≤-20℃保存,避免反復凍融。一旦使用,放到4℃解凍,保持冰冷且避光。


            二.動力學曲線建立(Kinetic curve)

            由于D-熒光素進入體內的生物分布非??焖偾覄恿W具組織依賴性,因此,研究人員需正式實驗前確定自身動物在D-熒光素注射后的成像采集最佳時間。通過建立動物模型的熒光素酶動力學曲線來完成。


            D-熒光素給藥的方式有腹腔注射(ip)、靜脈注射(iv)或皮下注射(sc),通常給藥方式為腹腔和靜脈。以下以腹腔注射為例。


            2.1 如下腹腔注射(i.p.)D-熒光素。如果給藥前需麻醉小鼠,需要注意此步操作可能稍微延長動力學(熒光素酶峰值表達時間)。

            2.2 a)如果在動物保持清醒時給藥,等待三分鐘,之后按照所選方法麻醉動物(氣化或注射麻醉)。b)將麻醉后動物置于成像室內,給藥后約5min開始第一次拍照。

            2.3 對于腹腔注射模型,每5-10min(最長達40-60min)拍一次照以建立熒光素酶表達的動力學曲線?!敬蠖鄶底⑸渎樽硭幊掷m20-30min,要完成一次完整的動力學研究可能需要再給一次麻醉藥物。使用2%異氟烷氣體麻醉健康動物能在活體成像系統如IVIS內安全放置45min?!?/span>

            2.4 根據模型建立的動力學曲線選擇最佳時間點采集圖像?!驹S多模型研究表明腹腔或皮下注射后約10-20min達到信號峰值,靜脈注射后約2-5min達到信號峰值?!?/span>


            三.腹腔注射(i.p.)技術要點

            最佳注射點(Preferred site)

            動物左下腹部(lower left abdominal quadrant)

            針頭大?。∟eedle size)

            25 gauge,通常與1ml(1 cc)注射器配套使用

            體積(Volume)

            每10g體重小鼠加入100μl 15mg/ml D-熒光素,相當于150mg/kg的給藥劑量?!靖骨粏未巫⑸?ml無刺激性溶液對動物無任何壓力】。

            動物位置(Position of animal):

            手動固定,背臥位(腹部向上),動物顱(頭部)朝下。輕輕晃動小鼠2-3次使得腸道向下移動,在下腹區域創造一個空腔。

            注射(Injection):

            Needle should be bevel-side up and slightly angled when entering the abdominal cavity. Penetrate just through abdominal wall (about 4-5mm). The tip of the needle should just penetrate the abdominal wall of the animal’s left lower abdominal quadrant.

             

            應用示例【生物化學發光體內成像】

            Fig. 1 Image illustrates the IVIS spectrum imager and a mouse placed inside the camera box.

             

            Fig. 2 Bioluminescence in vivo imaging. A. Representative luciferase time course (every 2 min) imaging of mice bearing subcutaneous tumors injected with luciferin. B. Graph illustrates the bioluminescence saturation of the whole mouse (displayed in A.) obtained

             

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            規格                 

            價格(元)      

            MX4602-100MG          

            D-Luciferin, Sodium Salt D-熒光素(鈉鹽)

            100mg

            998

            MX4602-500MG

            D-Luciferin, Sodium Salt D-熒光素(鈉鹽)

            500mg

            2500

            MX4602-1G

            D-Luciferin, Sodium Salt D-熒光素(鈉鹽)

            1g

            4500

            MX4603-100MG

            D-Luciferin, Potassium Salt D-熒光素(鉀鹽)

            100mg

            998

            MX4603-500MG

            D-Luciferin, Potassium Salt D-熒光素(鉀鹽)

            500mg

            2500

            MX4603-1G

            D-Luciferin, Potassium Salt D-熒光素(鉀鹽)

            1g

            4500

            MX4601-250MG

            D-Luciferin Firefly, Free Acid D-蟲熒光素(游離酸)     

            250mg

            1800

            MX4601-500MG

            D-Luciferin Firefly, Free Acid D-蟲熒光素(游離酸)

            500mg

            3000

            MX4601-1000MG

            D-Luciferin Firefly, Free Acid D-蟲熒光素(游離酸)

            1g

            5800

            MX4604-10MG

            DMNPE-caged Luciferin D-熒光素(DMNPE籠閉)

            10mg

            1350

            MX4604-50MG

            DMNPE-caged Luciferin D-熒光素(DMNPE籠閉)

            50mg

            5440

             

            注意事項

            1)   我司懋康生物(MKBIO)提供所有產品僅作科研用途,請不要用于臨床或診療用途。

            2)   為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

             

            附錄I 各種給藥途徑和模型動物的建議位點、針頭大小和注射體積

            給藥途徑           

            倉鼠

            小鼠

            大鼠

            IM肌肉注射

            位點

            體積

            大小  

            Quadriceps, gluteals

            ≤0.15 ml

            <23 gauge

            Quadriceps

            ≤0.03 ml

            <23 gauge

            Quadriceps, gluteals, triceps

            ≤0.25 ml

            <22 gauge

            IP腹腔注射

            位點

            體積

            大小

            Lower right quadrant of abdomen

            ≤3 ml

            <21 gauge

            Lower right quadrant of abdomen

            ≤2 ml

            <25 gauge

            Lower right quadrant of abdomen

            ≤5 ml

            <22 gauge

            IV靜脈注射

            位點

            體積

            大小

            Not recommended

            Lateral tail veins

            ≤0.5 ml

            <27 gauge

            Lateral tail or saphenous veins

            ≤2 ml slowly

            <22 gauge

            Intragastric 

            灌胃

            位點

            體積

            大小

            Stomach

            N/A

            18-22 gauge, 4-4.5cm long, Bulbed feeding needle

            Stomach

            5-10ml/kg

            18-22 gauge, 2-3cm long, Bulbed feeding needle

            Stomach

            5-10ml/kg

            15-18 gauge, 6-8cm long, 

            Bulbed feeding needle or 8 French flexible catheter

            SC皮下注射

            位點

            體積

            大小

            Neck, back

            ≤3 ml

            <21 gauge

            Neck, back

            ≤1 ml

            <22 gauge

            Neck, back,abdomen

            ≤5 ml

            <21 gauge

             

             

             

             — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

             


            上海懋康生物科技有限公司是一家涉足于生命科學和生物技術領域研究的試劑、儀器和實驗室消耗品與實驗服務工作,主要從事細胞生物學、植物學、分子生物學、免疫學、生物化學、蛋白組學。生物制藥與診斷試劑研發生產等領域。 本公司秉承“以人為本,以誠為信、合同守信”的經營理念。堅持"品質保障"的原則為廣大客戶提供優質產品。


            K
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